一、介紹

高壓液相色譜（HPLC）是分析化學(xué)和生物化學(xué)中常用的一種方法，用于將混合物中的化合物進(jìn)行分離，以便進(jìn)一步分析和純化。

在HPLC過(guò)程中，混合物中的組分通過(guò)被泵送的溶劑（稱為流動(dòng)相）穿過(guò)裝有硅基顆粒的柱子（稱為固定相）來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。每種組分（稱為分析物）根據(jù)其在流動(dòng)相和固定相之間的獨(dú)牛寺親和力，以不同的速度沿柱遷移，并在不同的時(shí)間從柱中流出，從而實(shí)現(xiàn)混合物的有效分離。

對(duì)流動(dòng)相具有較高親和力的分析物會(huì)沿著柱子遷移得更快，而對(duì)固定相具有較高親和力的分析物則遷移得更慢。這種遷移時(shí)間（稱為保留時(shí)間）對(duì)于每個(gè)分析物都是獨(dú)牛寺的，可以用于其鑒定。通過(guò)在柱后適當(dāng)使用檢測(cè)方法，每個(gè)分析物也可以被定量分析。

較小的柱填料顆粒尺寸可以提高色譜分辨率，但需要增加溶劑輸送壓力。進(jìn)一步減小柱填料顆粒尺寸可以允許更高的溶劑流速，從而在不犧牲分辨率的情況下減少分析時(shí)間。這正是超高效液相色譜（UHPLC）相對(duì)于其他液相色譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì)所在。

基本類(lèi)型的高效液相色譜柱化學(xué)：

• 正相色譜，例如硅膠顆粒

• 反相色譜，例如涂有C-18的硅膠

基本的流動(dòng)相輸送系統(tǒng)類(lèi)型：

• 等度洗脫 - 使用恒定溶劑混合物，例如在整個(gè)分離過(guò)程中使用10%的水在甲醇中。

• 梯度洗脫 - 隨時(shí)間變化的溶劑混合物，例如從純己烷開(kāi)始，然后逐漸增加乙酸乙酯的濃度，直到最后為純乙酸乙酯。

高效液相色譜系統(tǒng)的基本組件包括溶劑輸送泵、樣品進(jìn)樣口、柱子和檢測(cè)器。高效液相色譜的性能要求儀器具有典型液相色譜系統(tǒng)所不具備的特性。溶劑輸送必須是無(wú)脈沖的，并且在1毫升/分鐘到100微升/分鐘的流量范圍內(nèi)準(zhǔn)確校準(zhǔn)。

注射泵通常被認(rèn)為優(yōu)于活塞泵，適用于需要低且穩(wěn)定流速的高效液相色譜應(yīng)用。Teledyne ISCO注射泵是這些高性能應(yīng)用的優(yōu)秀高效液相色譜泵。

圖1：等度溶劑輸送系統(tǒng)

二、理論

Van Deemter方程是理解色譜法基本原理的關(guān)鍵。根據(jù)Van Deemter方程：

H = A + B/µ + Cµ

其中：H是柱子的板高，µ是流動(dòng)相的線性流速。A、B和C是常數(shù)。較小的板高H表示更高的分離分辨率。²

常數(shù)A是渦流擴(kuò)散項(xiàng)。渦流擴(kuò)散是由于柱中多條流動(dòng)路徑導(dǎo)致的，并且與流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)。由于填料顆粒的存在，分析物分子可以沿著不同長(zhǎng)度的多條路徑前進(jìn)。這些不同長(zhǎng)度的多重路徑使分析物分子分散開(kāi)來(lái)，并導(dǎo)致峰展寬。A項(xiàng)取決于固定相的緊密程度。固定相中的空隙會(huì)因通道效應(yīng)導(dǎo)致峰展寬。相比之下，較小的填料顆粒提供更小的路徑長(zhǎng)度差異，從而減少峰展寬。

B是縱向擴(kuò)散系數(shù)。它依賴于分析物分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)。更快的流動(dòng)相流速減少了停留時(shí)間，而分析物分子在柱中的較短停留時(shí)間減少了縱向擴(kuò)散的影響。這種減少有助于提高分離效率，因?yàn)榉治鑫锓肿油ㄟ^(guò)擴(kuò)散散開(kāi)的機(jī)會(huì)更少，這解釋了1/v因子。

C是分析物質(zhì)量傳遞系數(shù)。它取決于分析物分子在移動(dòng)相和固定相之間達(dá)到平衡所需的時(shí)間。如果這種平衡太慢，那么一些未能及時(shí)與固定相結(jié)合的分析物分子將會(huì)隨流動(dòng)相流下柱；而那些未能及時(shí)從固定相脫離的其他分子則被留下。更高的流動(dòng)相流速會(huì)導(dǎo)致分析物分子的擴(kuò)散，因此解釋了v因子。較小的固定相顆粒預(yù)計(jì)會(huì)有更短的平衡時(shí)間。

如上所述，較小的固定相顆粒或珠子應(yīng)該會(huì)降低A和C值。A項(xiàng)對(duì)H的貢獻(xiàn)較小，允許更高的分辨率。隨著C項(xiàng)對(duì)H值的影響變得不那么顯著，增加流動(dòng)相流速不會(huì)太多犧牲分離性能。這將允許在相同的分辨率下進(jìn)行更快的分離。盡管較小的柱珠可能不會(huì)直接影響B值，但較高的流速減少了其對(duì)H的貢獻(xiàn)。較小的柱珠將允許在更高分辨率下進(jìn)行更快的分離。³

較小的珠子將以較小的間隙填充，從而減小A值，但提供更高的溶劑流動(dòng)阻力。反過(guò)來(lái)，這需要更高的溶劑壓力。隨著蕞優(yōu)分離流速的增加，柱背壓隨固定相顆粒尺寸的立方成反比增加；即P∝1/d3。⁴通常，對(duì)于5 µm柱珠的HPLC需要1,000 psi的壓力，而對(duì)于1.7 µm柱珠的UHPLC則需要20,000 psi或更高的壓力。^1,4

圖2：梯度溶劑輸送系統(tǒng)

三、HPLC泵

往復(fù)式泵通常配有單活塞或雙活塞。活塞掃過(guò)的體積通常較小，約為100 µL。由于體積小，需要頻繁補(bǔ)充液體，導(dǎo)致周期性壓力下降。雙活塞泵比單活塞泵產(chǎn)生更平穩(wěn)的流動(dòng)，但并非總是理想的選擇。注射泵蕞適合要求高壓、無(wú)脈沖和精確流動(dòng)的高性能應(yīng)用。注射泵具有更大的缸體容積，高達(dá)1 L，并且在運(yùn)行期間通常不需要重新填充。因此，基線更加穩(wěn)定，沒(méi)有周期性的壓力下降。理想的泵應(yīng)能夠在等度或梯度模式下操作。

表1：常用推薦的HPLC泵

四、引用

1) Y. Shen and R.D. Smith, Electrophoresis 23 (2002) pp. 3106-3124.

2) D.A. Skoog and D.M. West, Fundamentals of Analytical Chemistry, 3rd edit., pp. 643-649.

3) D. Sievers, M.E. Swartz and B.J. Murphy, G.I.T. Laboratory Journal 5(2004) pp.43-45.(2004) pp. 503-504

4) L.A. Colon, J.M. Cintron, J.A. Anspach, A.M. Fermier and K.A. Swin-ney, The Analyst 129

5) L.R. Snyder, J.J. Kirkland and J.L. Glajch, Practical HPLC Method Development, 2nd edit., pp. 41-43.

6) J.C. Giddings, Dynamics of Chromatography: Part I Principles and Theory (Marcel Dekker, Inc., New York: 1965) pp. 25-26, 229-230.

7) J.M. Cintron and L.A. Colon, The Analyst 127 (2002) pp. 701-704.A.D. Jerkovich, J.S. Mellors and J.W. Jorgenson, LCGC 21 (July 2003) pp. 600-611.